دانشگاه آزاد اسلامي
واحد اروميه
دانشكده علوم پايه گروه زيست شناسي
پايان نامه براي دريافت درجه كارشناسي ارشد
رشته زيست فناوري(بيوتكنولوژي) گرايش ميكروبي
عنوان:
اپیدمیولوژی مولکولی پروتئینP2 غشای خارجی در هموفیلوس آنفلوانزا
استاد راهنما:
آقاي دكتر سيد داور سيادت
استاد مشاور:
آقاي دكتر سيد فضل الله موسوي
نگارش:
مرجان رحماني
شهریور1393
چکیده:
هموفیلوس آنفلوانزا،یک باکتری گرم منفی و پاتوژن اختصاصی انسانی است که از نظر بیماری زایی می‏تواند ایجاد مننژیت حاد باکتریایی ،سپتی سمی،اپی گلوتیت،باکتریمی،عفونت گوش میانی کند. هدف این مطالعه بررسی یکی از این پروتئین ها ی حفاظت شده در باکتری هموفیلوس آنفلوانزا به منظور طراحی واکسن بومی علیه ان می‏باشد. پروتئينP2 ، بين 38 الي 40 كيلودالتون وزن داشته و بيش از 50 درصد كل پروتئينهاي غشاء خارجي هموفيلوس را شامل مي‏گردد و غالبا توسط سويه‏هاي فاقدكپسول و سویه b هموفیلوس ها بيان مي‏شود.
این پروتئین به عنوان یک کاندیدای مناسب واکسن برای سویه‏های بدون کپسول هموفیلوس آنفلوانزا مطرح است. در این تحقیق ،اپیدمیولوژی ژن ompP2 با استفاده از نمونه‏های بالینی که از 30 بیمار جداسازی شده بودند،مورد بررسی قرار گرفت. باکتری ها در محیط شکلات اگار کشت داده شدند و تستهای بیوشیمیایی انها انجام شد. پس از تخلیص DNA،واکنش PCR انجام شد. همه نمونه ها از نظر وجود ژن ompP2) 1173(bp مثبت شدند. پس از تعیین توالی 6 نمونه و مقایسه توالی ژن ompP2 سویه‏های بومی با سویه‏های استاندارد و توالی موجود در بانک ژنی،با نرم افزار MEGA4 ،شباهت ها و تفاوت های ناشی از حذف ،اضافه و یا جابه جایی نوکلئوتیدی را نشان داد. جهت بررسی الگوی پلی مورفیسم ژن مورد نظر ،محصول PCR مورد هضم توسط آنزیم های Alu1 و EcoR1 قرار گرفتند. الگوی برش 21 نمونه (99%-98%) مشابه سویه‏های استاندارد باno:J3359. 1,M93268. 1,M93269. 1,M932701) (accessionبود و 9 نمونه (98%-91%) متفاوت بود. نتایج ما نشان دادکه ژن ompP2 از نظر سازماندهی ژنی،شبیه سویه‏های مختلف هموفیلوس آنفلوانزا ثبت شده در بانک ژنی است و در قسمت برش توسط آنزیم محدودالاثر Alu1دچار پلی مورفیسم شدند. لذا این پروتئین می‏تواند کاندید مناسبی برای واکسن باشد.
واژگان کلیدی: هموفیلوس آنفلوانزا،واکسن،ژن ompP2،PCR.
تقدیم به:
همسر مهربان، وفادار و عزیزم
پدر و مادر و خانواده مهربان و دلسوزم
پدر و مادر و خانواده با محبت همسرم
و
تقدیم به اساتید گرامی:
آنانکه به من آموختند
و در کشمکش دهر و عرصه پر تکاپوی حیات
بدون تملق و ریا در خدمت تعالی انسان هستند.
تشکر و قدردانی:
سپاس خداوندی را که سخنوران از ستودن آن عاجزند و حسابگران از شمارش نعمت‌های او ناتوان و تلاشگران از ادای حق او درمانده‌اند. در گذرگاه زمان روزی فرا می‌رسد بی انکه بخواهیم باید از رهنمایان خود جدا شویم و صاحبان معرفت را با عشق و محبت، بخشش، امتنان و سپاس شایان به خدای منان بسپاریم و برایشان ارزوی خوشبختی نماییم.
بر خود واجب می‌دانم به خاطر راهنمایی‏ها و الطاف بی شائبه‏ای که از اساتید بزرگوارم جناب آقای دکتر سیادت، جناب آقای دکتر موسوی، جناب آقای دکتر وزیری به جهت پیشبرد هر چه بهتر این پژوهش داشتند، سپاس گزاری نمایم. انجام این رساله فرصت مغتنمی‌ بود تا نگارنده از خرمن دانش و فضل این سروران خوشه چینی کند. همچنین بسیار شایسته خواهد بود تا خاشعانه نسبت به الطاف بی دریغی که سرکار آقای دکتر بادمستی و خانم دکتر بهاره رجایی و خانم نیک بین بر من روا داشتند، ابراز احترام کنم. همچنین از کلیه اساتید ،پرسنل و دوستان عزیزم در دانشگاه آزاد ارومیه و انیستیتو پاستور ایران، کمال تشکر و قدردانی را دارم و برای همه آرزوی موفقیت و شادکامی ‌دارم.
فهرست مطالب
عنوانصفحه
فصل اول: کلیات1
1-1-تاریخچه وطبقه بندی:2
1-2-مشخصات میکروسکوپی و ماکروسکوپی:4
1-3- کشت:4
1-4-آنتي ژنها وعوامل بيماريزایي5
1-4-1-عوامل اتصالي فيمبريه اي:7
1-4-2-سايرعوامل بيماريزائي:10
1-5-بيماريها و عوارض11
1-6- روش‏های تشخیص کلاسیک:13
1-7-اپیدمیولوژی14
1-7-1-جلوگیری از پنومونی14
فصل دوم: پیشینه پژوهش16
2-1- مقدمه17
2-2- تاریخچه18
فصل سوم: روش شناسی21
3-1- مواد و وسایل:22
3-2- دستگاه ها:24
3-3- محلول سازی:25
3-3-1- آماده سازی محیط کشت:25
3-3-2- محیط شکلات اگار:26
3-3-3- آماده سازی ژل اگارز 1 درصد:27
3-4- طراحی و روش اجرا:27
3-4-1- جمع‏آوری نمونه:27
3-5- کشت نمونه ها:27
3-6- تست ‌های بیوشیمیایی:28
3-7- رنگ آمیزی:29
3-8- نگهداری ایزوله‌های بالینی هموفیلوس آنفلوانزا در شرایط کرایو در دمای -80ْ:29
3-9- استخراج DNA30
3-9-1-استخراج DNA به روش جوشاندن:30
3-10- بررسی کیفیت و کمیت DNAاستخراج شده:30
3-11- راه اندازی و انجام PCR:31
3-12- واکنشPCR32
3-13- الکتروفورز محصول PCR:35
3-13-1- مواد و وسایل مورد نیاز:35
3-13-2- نحوه تهیه ژل اگارز و انجام الکتروفورز:35
3-14- تفسیر ژل الکتروفورز36
3-15- RFLP36
3-15-1- استخراج باند اصلی از روی ژل اگارز37
3-15-2- بررسی غلظت محصولات تخلیص شده توسط دستگاه نانودراپ:37
3-16- مواد و وسایل لازم برای RFLP:37
3-16-1- روش انجام RFLP باآنزیمAlu1:38
3-16-2- انجامRFLP باآنزیم محدودالاثر EcoR1:38
3-17- تعیین توالی و پردازش داده ها:38
3-17-1- ارسال نمونه‏ها جهت توالی یابی قطعه تکثیر شده:39
فصل چهارم: تجزیه و تحلیل داده ها40
4-1- تعداد نمونه‏ها و ایزولاسیون:41
4-2-تستهای بیوشیمیایی:42
4-3-نتایج بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراج شده:42
4-4- PCRژن ompP2 ایزوله‌های بالینی هموفیلوس آنفلوانزا:43
4-5- RFLP:44
4-6: نتایج تعیین توالی (Sequencing) و ثبت توالی‌ها دردیتابیسGeneBank/EMBL:45
4-7- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی نمونه ها:46
4-7-1- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 3:46
4-7-2. آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 5:47
4-7-3- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 8:48
4-7-4- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 35:49
4-7-5- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 47:50
4-7-5- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره14:51
4-8- بررسی میزان شباهت و تفاوت ایزوله‌های بالینی تهران:52
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری56
5-1- آنالیز RFLP از ایزوله‌های بالینی:57
5-2. آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 3:57
5-2-1آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 5:58
5-2-2- آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 8:58
5-2-3- آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 35:59
5-2-4- آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 14:60
5-2-5- آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 47:60
5-3- بحث:61
پیشنهادات:66
منابع67
فهرست منابع68
Abstract75
پیوست ها76
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول3-1- مواد تشکیل دهنده و مقدار حجم آنها برای PCRاز ompP234
جدول 3-2- برنامه PCR برای تکثیر ژن ompP234
جدول3-3- توالی پرایمرهای مورد استفاده برای ompP235
جدول 4-1- اطلاعات نمونه‌های دریافتی از بیماران مورد مطالعه41
جدول 4-2 نتایج بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراج شده42
جدول 4-3- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 3 در NCBI47
جدول 4-4- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 5 در NCBI48
جدول 4-5- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 8 در NCBI49
جدول 4-6- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 35 در NCBI50
جدول 4-7- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 47 در NCBI51
جدول 4-8-. نتیجهBlast سکانس اسید نوکئیک شماره 14 در NCBI52
فهرست اشکال
عنوان صفحه
شکل1-1- ساختارشیمیایی پلی ریبوزیل ریبیتول فسفا ت3
شکل1-3- کلو نی‌های هموفیلو س آنفولانزا روی محیط شکلات اگار5
شکل3-1-تست کاتالاز29
شکل 3-2- شکل باسیل گرم منفی هموفیلوس آنفلوانزا30
شکل 3-3- دستگاه ترموسایکلر34
شکل 3-4- دستگاه الکتروفورز36
شکل4-1- ژن ompP2 ایزوله‌های با لینی43
شکل 4-2و4-3- جایگاه برش آنزیم محدودالاثر Alu1برای ژنompP2 ایزوله‌های بالینی44
شکل 4-4- جایگاه برش آنزیم محدودالاثر ECOR1برای ژن ompP2ایزوله‌های بالینی44
شکل 4-5- کروماتوگرام به دست آمده از تعیین توالی ژن ompP2 نمونه شماره 14با پرایمر Forward45
شکل 4-6- کروماتوگرام به دست آمده از تعیین توالی ژن ompP2نمونه شماره 14با پرایمر Revers45
شکل 4-7- آنالیز و مقایسه نمونه شماره 3 با اطلاعات ثبت شده در Gene Bank و بررسی توالی اسیدآمینه آنها46
شکل 4-8- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 346
شکل 4-9- آنالیز و مقایسه نمونه شماره 5 با اطلاعات ثبت شده در Gene Bank و بررسی توالی اسیدآمینه آنها47
شکل 4-10- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 547
شکل 4-11- آنالیز و مقایسه نمونه شماره 8 با اطلاعات ثبت شده در Gene Bank و بررسی توالی اسیدآمینه آنها48
شکل 4-12- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 848
شکل 4-13- آنالیز و مقایسه نمونه شماره 35 با اطلاعات ثبت شده در Gene Bankو بررسی توالی اسیدآمینه آنها49
شکل 4-14- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 3549
شکل 4-15- آنالیزو مقایسه نمونه شماره 47با اطلاعات ثبت شده در Gene Bankو بررسی توالی اسیدآمینه آنها50
شکل 4-16- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 4750
شکل 4-17- آنالیزو مقایسه نمونه شماره 14 با اطلاعات ثبت شده در Gene Bank و بررسی توالی اسیدآمینه آنها51
شکل 4-18- نواحی حفاظت شده پروتئین شماره 1451
شکل 4-19- مقایسه ساختمانی اسیدآمینه پروتئینP2 ایزوله‌های بالینی با همدیگر54
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار 4-1- نتایجRFLP 52
نمودار 4-2- میزان درصد هر یک از الگو ها53
نمودار 4-3- درصد جهش ها53
فصل اول:
کلیات
1-1-تاریخچه وطبقه بندی:
هموفیلوس آنفولانزا اولین بار در پاندمی ‌ویروس آنفولانزا توسط فایفر1 در سال 1892 معرفی شد ( (Murley et al, 1988 (Reddy et al, 1996. فایفر گزارش کرد در نمونه خلط بیماران مبتلا به آنفولانزا یک باکتری ناشناخته مشاهده شده، که نام آن را باسیل فایفر گذاشت و تا چندین سال تصور بر این بود که این باکتری عامل بیماری آنفولانزا است به همین خاطر به آن آنفولانزا نیز می‏گفتند. بعدها مشخص شد که این باکتری به عنوان یک عفونت ثانویه در دستگاه تنفسی مبتلایان به ویروس آنفولانزا مطرح است (Peltola H, 2000). چهل سال بعد از فایفر، پیتمن2 نشان داد که هموفیلوس آنفولانزا می‏تواند به دو دسته کپسول‏دار و بدون کپسول تقسیم شود. وی شش تایپ پلی ساکارید کپسولی از این باکتری را بر مبنای خاصیت آنتی ژنیک آنها معرفی کرد که کپسول آنها مسئول ویرولانس ارگانیسم است. ساختار این کپسول‏ها بعدها شناسایی شد. این شش تایپ راa تاf نامیدند (;Cotter D et al, 2002 ;Murley et al, 1998 (Murphy et al, 1993; Reddy et al, 1996 . (از بین این شش سروتایپ کپسول‏دار، سروتایپ b هموفیلوس آنفولانزا (Hib) تقریبا در 90 درصد موارد ابتلا، اصلی‏ترین عامل مننژیت باکتریایی در کودکان زیر 5 سال، عامل 95 درصد بیماری‏های مهاجم دیگری همچون باکتریمی، پنومونی و سپتی سمی‌ در کودکان و مسئول نیمی ‌از بیماری‏های مهاجم بزرگسالان همچون سلولیت، اپی‏گلوتیت، لارنژیت و ارتریت چرکی می‏باشد (;Haase et al, 1994 (Murphy et al, 1993.
پیتمن همچنین مشاهده کرد که تمام سویه‏های جدا شده از مایع نخاعی و خون بیماران از تایپ b کپسول‏دار است (Reddy et al, 1996). عفونت سیستمی‌در کودکان توسط گونه‏های این باکتری در سراسر دنیا اتفاق می‏افتد و میزان شیوع آسیبهای نورولوژیک، این باکتری را به یک نگرانی عمومی ‌برای سلامت افراد تبدیل کرده‏است (; Haase et al, 1994 ( Murley et al, 1998.این باکتری توسط کپسول پلی‏ساکاریدی از جنس قند پنج کربنه (پنتوز) که پلی‏مری از واحدهای تکراری پلی ریبوزیل ریبیتول فسفات 3 (PRP)می‌باشد، از فاگوسیتوز توسط ماکروفاژها محافظت می‏گردد (Reddy et al, 1996) ; Kubiet&Ramphal, 1995) .).
جنس پلی‏ساکارید در سایر سروتایپ‏های کپسول‏دار از قندهای شش کربنه (هگزوز) می‏باشد. به عنوان مثال کپسول تایپ a پلی‏مری از گلوکز ریبیتول فسفات است(Musser et al, 1986).
شکل1-1- ساختار شیمیایی پلی ریبوزیل ریبیتول فسفات

کانون اولیه عفونت در سویه‏های کپسول‏دار معمولاً نازوفارنکس است و کپسول در استقرار باکتری در سطوح مخاطی و مقاومت باکتری در مقابل پاسخ‏های ایمنی در مکان استقرار نقش دارد. سویه‏های تایپ e و f بعد از تایپ b، رایج‏ترین سویه‏های طبقه‏بندی شده هستند که می‏توانند بیماری ایجاد کنند. همچنین بیماری ناشی از تایپ a هم گزارش شده است. موارد مننژیت ایجاد شده توسط سروتایپ‏های a و e و f نیز گزارش شده، اگرچه دقیقا مشخص نیست مننژیت معمول‏ترین بیماری کلینیکی این سروتایپ‏ها باشد (Cotter et al, 2002).
75 درصد سویه‏های هموفیلوس آنفولانزا فاقد کپسول هستند که به انواع “غیر قابل طبقه‏بندی”4 (NTHi) معروفند. این سویه‏ها در قسمت فوقانی دستگاه تنفس کلونیزه شده و کانون اولیه عفونت حلق و بینی است، اگرچه امکان گسترش دامنۀ عفونت از این نواحی به سایر نقاط مثل سینوس‏ها و گوش میانی وجود دارد، که می‏تواند باعث عفونت گوش‏میانی(اوتیتیس مدیا)5 در بچه‏های خردسال شود(Murphy et al, 1993) .(Kubiet&Ramphal, 1995;Reddy et al, 1996;Moreno , 1999)همچنین از سویه‏های فاقد کپسول بیماری‏هایی همچون سینوزیت، کانژاکتیویت6، پریکاردیت و اندومتریت گزارش شده است (Sukupolvi-Petty et al, 2006).
1-2-مشخصات میکروسکوپی و ماکروسکوپی:
هموفیلوس آنفولانزا کوکوباسیل‏ گرم منفی، کوچک (3/0 × 1 میکرومتر)، غیرمتحرک، بدون اسپور، بی‏هوازی اختیاری و سخت رشد از خانواده پاستورلاسه است. پلی‏مورفیسم به خصوص در باکتری‏های جدا شده از کشت کهنه مشهود بوده و می‏توان آن را به اشکال کوکوئید، کوکوباسیل، باسیل و یا اشکال رشته‏ای مشاهده کرد ((Sukupolvi-Petty et al, 2006;Reddy et al, 1996.
بر روی محیط کشت جامد شکلات ‏اگار کلونی‏های باکتری صاف، بی‏رنگ تا مایل به خاکستری، بسیار کوچک به ‏قطر 2-1 میلی ‏متر بعد از 24 ساعت انکوباسیون ظاهر می‏شوند. مورفولوژی باکتری به محیط و سن کشت بستگی دارد. در کشت‏های 8-6 ساعته در محیط کشت غنی، کوکوباسیل‏های کوچک برتری دارند و در کشت‏های کهنه اشکال میله‏ای بلند Sukupolvi-Petty et al, 2006)).
1-3- کشت:
کشت باکتری در محیط شکلات اگار انجام می‏گیرد. این باکتری بسیار حساس است و برای رشد خود به هر دو فاکتور X و V موجود در خون نیاز دارد که به این ترتیب با دیسک‏گذاری در محیط شکلات اگار از سایر گونه‏های هموفیلوس متمایز می‏شود
(Cotter et al, 2002، (Reddy et al, 1996;Pickering et al, 2002;. دمای 37-35 درجه سانتی‏گراد، وجود ایزو ویتال X در محیط و 5 درصد دی ‏اکسیدکربن باعث رشد بهینه باکتری می‏گردد. هموفیلوس آنفولانزا بر روی محیط بلاداگار با خون گوسفند رشد نکرده و همولیز ایجاد نمی‏کند، تنها اطراف کلونی‏های استافیلوکوک به دلیل لیز گلبول‏های قرمز و ترشح فاکتور XوV (پدیدۀ اقماری) می‏تواند رشد کند ( ). از انجایی که این باکتری به پیش‏ساز هم برای رشد خود نیاز دارد، آن را هموفیلوس به معنی دوستدار هم نامگذاری کرده‏اند. فاکتور Xاز نظر فیزیولوژیکی مانند همین عمل می‏کند و فاکتور V می‏تواند با نیکوتین امید ادنین ‏دی ‏نوکلئوتید (NAD) جایگزین شود (Winkelstein, 1996).
شکل1-3- کلونی‌های هموفیلوس آنفولانزا روی محیط شکلات اگار
1-4-آنتي ژنها وعوامل بيماريزایي
كپسول :
كپسول اين باكتري‏ها پلي‏ساكاريدي است كه در سروتيپ b از پليمريزاسيون‏ جفت ‏مونومرهاي قندهاي 5 كربنه (پنتوز) بوجود مي‏ايد، ولي در ساير سروتيپ‏ها شامل جفت‏ مونومرهاي قندهاي 6 كربنه (هگزوز) مي‏باشد كه پليمريزه گرديده‏اند. PRP در هموفيلوس آنفلوانزا سروتيپb ، از واحدهاي خطي ريبوز (قند5 كربنه)،ریبيتول و يك مولكول فسفات با پيوند فسفو دي‏ استري تشكيل‏ گرديده است. سويه‏هاي كپسول‏دار هموفيلوس آنفلوانزا را به 6 سروتيپ aالي f تقسيم نموده‏اند. (Schouls et al, 2006)
بااينحال، حدود 75 درصد سويه‏هاي اين باكتري، فاقد كپسول هستند. كپسول در هر 6 سروتيپ هموفيلوس آنفلوانزا به عنوان عامل بيماري‏زائي بسيار مهمي تلقي مي‏شود. سويه‏هاي كپسول‏دار عمدتاً در ايجاد عفونتهاي مهاجم، سيستميك و منتشر مثل مننژيت دخالت دارند، درحاليكه سويه‏هاي بدون كپسول معمولاً موجب عفونت در بافتهائي مي‏شوند كه قبلا بنحوي آسيب ديده باشند، مثال: در دستگاه تنفس مبتلايان به برونشيت مزمن و يا فيبروز سيستيك.7 (Mandell et al, 2010)
كپسول سروتيپ b هموفيلوس آنفلوانزا از واحدهاي ريبوزيل ريبيتول فسفات تشكيل شده و از اينرو به پلي‏ ريبوزيل ريبيتول فسفات ياPRP مشهور است و در مقاومت باكتري در برابر بيگانه‏خواري گلبولهاي سفيد خصوصا نوتروفيلها نقش اساسي دارد. بعلاوه، ثابت شده كه كپسول هموفيلوس‏ها باعث مهار فعاليت‏هاي باكتريسيدال8 و اپسونوفاگوسيتوز9 وابسته به كمپلمان خصوصا مسير فرعي(الترناتيو) آن در برخي از بيماران مي‏گردد. از طرفي مشخص شده كه PRP نقش مهمي در ايجاد التهاب در مننژ و تشديد آن برعهده دارد .(Winkelstein, 1996)
ژنهاي دخيل در توليد PRP بصورت2 نسخه از يك لوكوس ژني موسوم به cap B بر روي كروموزوم باكتري در منطقه‏اي بطول kb18 قرار گرفته‏اند. در حاليكه در كروموزوم ساير سويه‏هاي هموفيلوس تنها يك نسخه از اين ژن موجود است.
اخيراً مشخص گرديده كه سويه‏هاي فاقد كپسول نيز يك نسخه از اين ژن را با خود حمل مي‏كنند. چنين سويه‏هایي قدرت انتشار محدودي در خون داشته و بالعكس قدرت چسبندگي‏شان به سلول‏هاي اپي‏تليال تا 50 برابر سويه‏هاي كپسول‏دار افزايش يافته است Sukupolvi-Petty et al, 2006)).
1-4-1-عوامل اتصالي فيمبريه اي10:
پيلي هماگلوتينه كننده11:
پروتئين‏هاي مختلفي در تشكيل اين نوع پيلي دخالت دارند كه به پروتئين‏هاي Hif مشهور هستند. از اين ميان، انواع A تاF نقش مهم‏تري برعهده دارند. در راس پيلي پروتئين Hif A و در قسمت بدنه آن غالبا پروتئين‏هايHif D، Hif E قرار دارند. نقش اصلي اين پيلي، افزايش توانائي اتصال باكتري به مخاط و سلول‏هاي اپي‏تليال دستگاه تنفس فوقاني انسان مي‏باشد. تغييرات فاز انتي‏ ژنيك در پروتئين‏هاي تشكيل دهنده پيلي مذكورگزارش شده است(van Ham et al, 1995;Nakamura et al, 2006).
Hia/Hsf :
تقريباً تمام سويه‏هاي هموفيلوس آنفلوانزاي فاقد كپسول كه درعين حال فاقد پروتئين‏هاي اتصالي HMW1 وHMW2 باشند، واجد ژن‏هاي كدكننده پروتئين فوق ( hia، hsf) هستند.
نواحي امينواسيل و كربوكسيل هردو پروتئين از همولوژي بالائي برخوردارند. پروتئين‏هاي مذكور در اتصال محكم ميان باكتري و سلول‏هاي اپي‏تليال تنفسي، نقش بسزائي دارند (Cotter et al, 2005).
پروتئين P5:
نوعي پروتئين غشاء خارجي باكتري است كه علاوه بر دخالت در اتصال باكتري به سلول‏هاي ميزبان، درايجاد تغييرات انتي ژنيك باكتري نيز مؤثر مي‏باشد. اين پروتئين در بروز دريفت‏هاي انتي‏ژني نقش داشته و خصوصيات انتي‏ژني آن از سويه‏اي به سويه ديگر متفاوت است. پروتئينP5 معمولاً به گليكوپروتئينهائي موسوم به CEACAM 1كه در سطح سلول‏هاي اپيتليال تنفسي بيان ميشوند، متصل ميگردد.
( Kyde et al,2003),
پروتئين‏هاي غشاء خارجي P2وP6:
دو پروتئين غشاء خارجي مهم ديگر نيز در هموفيلوس آنفلوانزا شناسائي شده است كه عبارتنداز: P2 وP6.
پروتئينP2، بين 38 الي 40 كيلودالتون وزن داشته و بيش از 50 درصد كل پروتئين‏هاي غشاء خارجي هموفيلوس را شامل مي‏گردد و غالباً توسط سويه هاي فاقدكپسول بيان مي‏شود( Haaseet al, 1994.
(ompP2)،از عمده ترینomp ‌ های غشایی می‌باشد، عملکرد‌هایی شبیه یک پورین دارد و جرم مولکولی آن در میان گونه‏ها از (36000) تا (42000) دالتون متفاوت است. این تفاوت در جرم مولکولی در طول مولکول‌هایP2 ، پایه‏ای را برای یک سیستم طبقه بندی12برای NTHiفراهم می‌کند. پروتئین P2 سویه‌های Nontypeable در سویه‌های خیلی خاص، که در سطح خود دارای اپی توپ‌هایی میباشند، که از نظر ایمنی غالب13هستند را به میزان بالایی بیان می‌کنند.
پروتئینP2 همچنین یک هدف برای آنتی بادیهای کشنده باکتری در سرم انسان است. تفاوت‌های آنتی ژنی در مولکول‌های P2 در میان سویه‌های NTHi ممکن است یک پاسخ ایمنی در میزبان برای یک سویه خاص را القا کند و اجازه دهد دیگر سویه‏ها سبب عفونت راجعه شوند.
ناهمگونی آنتی ژنی در مولکول P2در میان سویه‌های NTHiبه علت تنوع توالی ژنی در مناطق مشخصی از ژنompP2 وجود دارد. تنوع جرم مولکولی در میان پروتئین‌های P2به علت تفاوت در اندازه مناطق متغیر است.
پروتئین‌های P2 از سویه‌های Nontypeable کاملاً متفاوت از همدیگر هستند. در حالی که P2سویه‌های نوع b کاملاً حفاظت شده14هستند. مطالعات حاضر نشان داد علت تفاوت در پروتئین P2 سویه‌های Nontypeable،تنوع‌هایی است که در جایگاه‌های خاص در داخل ژن ompP2 دارند. این مشاهدات با مطالعات الوآنزیم نوع الکتروفورتیک سازگار است که نشان میدهد که سویه‌های نوع b اساسا کلونال هستند. در حالیکه سویه‌های Nontypeable از نظر ژنتیکی گوناگون15 هستند.
مطالعات قبلی نشان داده‏اند که اپی توپ‌های اختصاصی گونه پروتئین P2 از سویه‌هایNontypeable ، اپی توپ‌های غالب از لحاظ ایمنی هستند.
سطح بالایی از شباهت میان پروتئین‌های P2، نشان میدهد که انها دارای منشا مشترک ساختار و عملکرد یکسان می باشند. چهار ناحیه‏ی متغیر که از لحاظ طول در میان سویه‏ها متفاوتند، به نظر می‌رسد که در ساختار سوم این مولکول نقشی ندارند، اما ممکن است لوپ‌های خارج غشایی در سطح سلول ایجاد کنند، جایی که آنها در تعامل با میزبان هستند.
پروتئين P6 هم نوعي ليپوپروتئين وابسته به پپتيدوگليكان است كه 6/16 كيلودالتون وزن داشته و درميان سويه‏هاي مختلف هموفيلوس آنفلوانزا از همولوژي 97 درصد برخورداراست. (Murphy et al, 1986)
اين پروتئين، 1 تا 5 درصد از كل پروتئين‏هاي غشاء خارجي هموفيلوس را دربر مي‏گيرد. بطور كلي ليپو پروتئين‏هاي وابسته به پپتيدوگليكان را مي‏توان در بسياري از باكتري‏هاي گرم منفي همچون لژيونلا، هموفيلوس دوكري، سراشيا، بروسلا ابورتوس، كمپيلو باكتر ژژوني، هليكوباكتر پيلوري یافت , 2009) (Metcalf,
هر دو پروتئين فوق ، ايمونوژن بوده و بعنوان كانديداي واكسيناسيون برعليه هموفيلوس آنفلوانزا مطرح داخل غشائي اين پروتئين بصورت حفاظت شده و پايدار هستند، اما مناطق خارج غشایي آن بشدت ناپايدار و متغيرند. (Roche&Maxon, 1994)
اما پروتئين P6 بشدت حفاظت شده است و القاء كننده انتخابي مناسبي براي سايتوكاينهاي پيش التهابي ماكروفاژهاي انساني مي‏باشد. اين پروتئين مي‏تواند پاسخهاي مناسبي از ايمني هومورال و نيز ايمني سلولي را عليه هموفيلوس آنفلوانزا بخصوص سويه‏هاي فاقد كپسول اين باكتري، برانگيزد. از آنجا كه پروتئين P6 داراي طبيعت پايداريست، لذا آنتي بادي‏هاي باكتريسيدالي كه برعليه آن در سرم توليد مي‏شوند نيز از تاثير طولاني مدتي برخوردارند و از اينروست كه اين پروتئين همچنان يكي از كانديداهاي مناسب جهت واكسيناسيون عليه سويه‏هاي فاقد كپسول هموفيلوس بشمارمي‏ايد.( Ishida et al, 2006;Berensone et al, 2005)
پروتئين D :
اين ليپوپروتئين 42 كيلودالتوني كه از سال 2008 به بعد مورد توجه قرارگرفته، در سطح خارجي كليه سويه‏هاي هموفيلوس آنفلوانزا يافت شده و كاملا پايدار مي‏باشد. در واقع پروتئين مذكور را مي‏توان نوعي فسفودي استراز دانست كه سبب آسيب ديدن سلول‏هاي مژه‏دار نازوفارنكس مي‏شود. پروتئين D باعث آزاد شدن فسفريل كولين از سلول‏هاي اپيتليال انساني مي‏گردد. محققان بتازگي دريافته‏اند كه اين پروتئين يكي از بهترين كانديداها جهت واكسيناسيون برعليه سويه‏هاي فاقدكپسول هموفيلوس آنفلوانزا مي‏باشد و استفاده از آن در يك واكسن 11 ظرفيتي بصورت كونژوگه با كپسول پلي ساكاريدي پنوموكوك سبب محافظت چشمگير در مقابل التهاب گوش مياني كودكان گرديده است. (Forsgren et al 2009;Prymula et al, 2006)

1-4-2-سايرعوامل بيماريزائي:
ليپواوليگو ساكاريد:
ليپواوليگوساكاريد (LOS) هموفيلوس آنفلوانزا شباهت زيادي با LOS نايسريا داشته‏ و اندوتوكسين باكتري بشمار مي‏ايد و دركليه سويه‏هاي هموفيلوس آنفلوانزا يافت مي‏شود. ليپو اوليگوساكاريد باكتري علاوه بر دخالت در ايجاد فعاليت‏هاي التهابي مثل تب، تجمع پلاكت‏ها و نظايران، در استقرار و كلونيزاسيون باكتري در دستگاه تنفس نيز نقش دارد. از ليپواوليگوساكاريد سميت زدائي شده هموفيلوس آنفلوانزا بصورت كونژوگه با برخي پروتئين‏هاي غشاء خارجي باكتري بعنوان كانديدي جهت واكسيناسيون برعليه سويه‏هاي فاقدكپسول هموفيلوس استفاده شده است (Swords et al, 2002;Swords et al, 2001),
هموسين16:
نوعي باكتريوسين است كه از عوامل بيماريزائي مهم هموفيلوس آنفلوانزا تيپ b بشمار مي‏رود و توسط بيش از 90 درصد از سويه‏هاي اين باكتري توليد مي‏گردد اين پروتئين براي سويه‏هائي از هموفيلوس كه قادر به توليد آن نباشند، اثرات سمي و كشنده دارد.
سويه‏هاي مولد هموسين نسبت به ساير سويه‏ها از قابليت‏هاي كلونيزاسيون و تهاجم بيشتري برخوردارند. (Murley et al, 1998)

پروتئازIgA1:
بيش از 97 درصداز كل سويه‏هاي فاقد كپسول هموفيلوس آنفلوانزا، اين انزيم را توليد ميكنند. شباهتهاي ساختماني بين انزيم فوق و Hap وجود دارد. پروتئاز مذكور با غيرفعال نمودنIgA1 ، ايمني مخاطي را خصوصا در ناحيه نازوفارنكس مختل ميكند (Winn et al, 2006).
1-5-بيماريها و عوارض
سويه‏هاي كپسول‏دار باكتري موجب مقاومت دربرابر فاگوسيتوز مي‏گردد. درعوض، سويه‏هاي بدون كپسول با تهاجم به سطوح مخاطي ميزبان باعث ايجاد بيماري مي‏گردند. تظاهرات باليني عمده ناشي از هموفيلوس آنفلوانزا عبارتست از:
مننژيت باکتریایي:
اگرچه سن بروز بيماري در جمعيت‏هاي مختلف متفاوت بوده و تاحدي به استفاده از واكسن بستگي دارد، اما عمدتاً كودكان زير 2سال را گرفتار مي‏نمايد. شايع‏ترين علائم به هنگام مراجعه به پزشك شامل تب و اختلال در عملكرد طبيعي دستگاه عصبي مركزي است. سفتي عضلات گردن ممكن است مشاهده گردد يااصلا گزارش نشود.
اگرچه ميزان ابتلا به مننژيت هموفيلوسي بالاست، اما ميزان مرگ ناشي از آن حدود 5 درصد است. 6 درصد كساني كساني كه بهبود مي‏يابند، دچار كاهش شنوائي عصبي گرديده و نيمي از افراد بهبود يافته دچار كاهش نسبي شنوائي و تاخير در تكامل كلامي مي‏شوند(Mandell et al, 2010)..
اپي‏گلوتيت:
در اين بيماري، اپي گلوت دچار التهاب و تورم گرديده، مي‏تواند به انسداد حاد راههاي فوقاني تنفس و مرگ منتهي شود. اين بيماري عفوني معمولاً در سنين بين 2 تا 7 سال ايجاد مي‏گردد كه از علائم مهم آن مي‏توان به گلودرد شديد، تب، اشكال در بلع، سرازير شدن آب دهان و حالت خفگي اشاره كرد. سرخپوستان واسكيموهاي الاسكا نوعي مقاومت ذاتي در برابر اين بيماري دارند. (Mandell et al, 2010, P2911-2921)
سلوليت :
سلوليت ناشي از هموفيلوس آنفلوانزا عمدتاً در كودكان خردسال ايجاد مي‏شود. شايع‏ترين محل درگيري در ناحيه سر و گردن است و نواحي مبتلا گاهي رنگ مشخص آبي مايل به قرمز بخود مي‏گيرند. اغلب بيماران گرفتار باكتريمي هستند و در 10 درصد آنها كانون عفوني ديگري هم به چشم ميخورد (Mandell et al, 2010, P2911-2921).
پنومونی:
هموفيلوس آنفلوانزا تيپ b علاوه بر ايجاد عفونتهاي فوق مي‏تواند باعث ايجاد پنوموني در نوزادان گردد. از لحاظ باليني نمي‏توان اين پنوموني رااز ساير پنومونيهاي باكتريال افتراق داد، بجز اينكه درگيري ناحيه جنب (پلور) در اين نوع ذات الريه بيشتر است. (Mandell et al, 2010, P2911-2921)
از ديگر بيماري‏هاي عفوني ناشي از سويه‏هاي كپسول‏دار خصوصا سروتيپ b كه از شيوع كمتري برخوردارند، ميتوان به التهاب استخوانها و مفاصل، التهاب پريكارد قلب، اندوفتالميت، عفونت مجاري ادراري، آبسه و باكتريمي بدون كانون مشخص اشاره كرد.
از جمله بيماري‏هاي عفوني ناشي از سويه‏هاي فاقدكپسول هموفيلوس آنفلوانزا مي‏توان به موارد زيراشاره نمود:
پنومونی اكتسابي از جامعه :
هموفيلوس آنفلوانزاي فاقد كپسول، پس از پنوموكوك به عنوان شايعترين عامل پنوموني اكتسابي از جامعه شناخته شده است. پنومونی ناشي از اين باكتري، شيوع بالائي درميان بيماران مبتلا به بيماري‏هاي مزمن ريوي و ايدز دارد. بيمار معمولاً با شكايت تب، سرفه و خلط چركي كه چند روز بطول انجاميده به پزشك مراجعه مي‏كند(Murley et al, 1998).
التهاب گوش مياني :
بجز پنوموكوك و موراكسلا17، هموفيلوس آنفلوانزاي بدون كپسول نيز به عنوان سومين عامل شايع التهاب گوش مياني در اطفال مطرح مي‏باشد. شيرخواران معمولاً تب دار و بيقرارند، اما بچه‏هاي بزرگتر غالباً از درد گوش شكايت دارند. اين التهاب معمولاً پس از يك عفونت ويروسي در دستگاه تنفس فوقاني بروز مي‏نمايد(Foxwell, 1998).
از ديگر بيماري‏هاي عفوني ناشي از سويه‏هاي فاقدكپسول هموفيلوس آنفلوانزا مي‏توان به سينوزيت، سپسيس پس از زايمان، باكتريمي نوزادان، سلوليت، التهاب چركي مفاصل، اندوكارديت، عفونت مجاري ادراري و عفونتهاي داخل شكمي اشاره كرد(Murley et al, 1998).
1-6- روش‏های تشخیص کلاسیک:
الف- نمونه‏ها: برای تهیه گستره و کشت، نمونه از سو آب نازوفارنکس، چرک، خون و مایع مغزی- نخاعی گرفته می‏شود.
ب- آزمایش میکروسکوپی: این ،تست حساسی برای شناسایی هموفیلوس آنفلوانزا در CSF، مایع سینوویال و در قطرات تنفسی به مقدار کمتر است.
پ- شناسایی مستقیم: این روش براساس تشخیص ایمونولوژنیک آنتی ژن‏های هموفیلوس آنفلوانزا در مایع نخاعی می‏باشد یک ازمون مثبت ، بیانگر وجود غلظت بالایی از پلی ساکاریدهای اختصاصی هموفیلوس آنفلوانزاتیپ b دراین مایع می‏باشد. این ازمون‏های شناسایی آنتی‏ژنی معمولاً حساس‏تر از رنگ‏آمیزی گرم نیستند و در نتیجه کاربرد گسترده‏ای ندارند و از طرفی جهت تهیه واکسن علیه هموفیلوس آنفلوانزا ارزش زیادی ندارند. از جمله این روشها می‏توان به تست اگلوتیناسیون لاتکس و کانتر ایمونوالکتروفورزیس اشاره کرد.
ت- کشت: برای ظهور کلنی‏های تیپیک، نمونه‏ها (24 تا 48 ساعت) در اگار شکلاتی غنی شده با Isovitalex رشد داده می‏شوند.
هموفیلوس آنفلوانزا به واسطه احتیاج به فاکتورهای V، X، همچنین عدم تولید همولیز در اگار خونی از سایر باسیل‏های گرم منفی مشابه افتراق داده می‏شود.
1-7-اپیدمیولوژی
Hib، به طور غالب یک عامل بیماری زا در دوران کودکی است که در 80 % موارد اتفاق افتاده در جهان باعث ابتلا.کودکان کمتر از 5 سال می‏شود.
قبل از اینکه واکسیناسیون اغاز شود، Hib یکی از معمول ترین عوامل باکتریایی بود که پنومونی و مننژیت در کودکان بین سنین 4 و 18 ماه، با سرعت مرگ و میر بالا در جهان ایجاد می‌کرد.
Hib، قبلا معمول ترین عامل ایجاد مننژیت در کودکان استرالیایی بود.
بومیان و کودکان جزایر تنگه تورس18، مخصوصا آنهایی که در دوردست و نواحی روستایی زندگی می‌کردند بیشترین میزان ابتلاء به بیماری Hibرا داشتند و در کودکان کم سن غیر بومی‌ نیز وجود داشت. اپی گلوتیت Hib تقریبا در کودکان بومی‌کمیاب بود.
در قبل از اغاز واکسیناسیون کودکان بومی‌استرالیایی، در شمال تری توری19 بیشترین سرعت حمله بیماری وجود داشت نسبت به ایجاد بیماری Hib در سرتاسر جهان با اغاز واکسیناسیون بر علیه Hib یک کاهش در شیوع بیماری Hib در استرالیا و دیگر کشورهایی که در برنامه واکسیناسیون، واکسن Hib بود ایجاد شد. برنامه بین المللی واکسیناسیون ابتدا در سال 1993 در استرالیا استفاده شد و به سرعت بیماری ایجاد شده توسط Hib در بومیان و هم غیر بومیان کاهش پیدا کرد.
در قبل از اغاز برنامه واکسیناسیون 500 مورد مبتلا به Hibبه 15-10 مورد با شروع واکسیناسیون این تعداد به 20 مورد در سال تقلیل یافت.
1-7-1-جلوگیری از پنومونی
عدم کاهش قطعی پنومونی در مطالعه لومبوک متفاوت بود با نتیجه دیگر مطالعات واکسن Hib.
محققان پیشنهاد کردند که موارد شدید پیدا شده آنها منتهی به شناخت تعداد زیادی از کودکان با پنومونی ویروس و غیر باکتریال شده که شناخت چنین مواردی ممکن است تاثیر پنومونی Hib را پیچیده‏تر و دشوارتر کند.
آنها همچنین این موضوع را بیان کرده‏اند که سهم پنومونی ناشی از Hib ممکن است در آسیا پایین‏تر از دیگر جاها باشد.
پس از دریافت حداقل یک دوز از واکسن میزان بروز قطعی مننژیت Hib در 2 سال اول زندگی از 19 به 6/2 در هر 000/100 نفر کاهش یافت که نشان دهنده قدرت بازدارندگی واکسن به میزان 16(95%) در هر 000/100 کودک بود.
حداقل 1 دوز از واکسن 22% موارد کلینیکی مننژیت را جلوگیری کرد که میزان بازدارندگی واکسن 158 در هر 000/100 کودک (95%) است.
اطلاعات محدودی در مورد تاثیر واکسن Hibاز دیگر کشورهای آسیایی وجود دارد.
مطالعات کنترل موارد ابتلا که در داکا در بنگلادش که برروی تقریبا 000/68 نوزاد انجام شد 25 حجم بالای بیماران و 6 حجم پایین بیماران ایمونیزاسیون کرد تا واکسن Hib-DPT را تهیه کند.
در حالی که دیگر کلینیک‏ها به تهیه واکسن DPT معمولی ادامه دادند پوشش‏دهی واکسن بر مبنای مطالعه منطقه‏ای بود که از استاندارد WHO cluoterr surcey methodology استفاده شد.
از این مطالعات این برداشت شد که کودکانی که حداقل 2 دوز از واکسن کونژوگه Hib را دریافت کرده‏ بودند بروز قطعی مننژیت Hib و پنومونی ناشی از آن 89% و 34% پایین‏تر از جوامع کنترل در طی تقریبا 3 سال تحقیق موردی بود.
فصل دوم:
پیشینه پژوهش
2-1- مقدمه
هموفیلوس آنفلوانزا اولین ارگانیسم زنده‏ای بود که ژنوم آن توسط دانشمندان، کاملاً تعیین توالی20شد و شامل 1830137 جفت باز DNA در یک کروموزوم حلقوی است، که 1740 ژن‌های کد کننده پروتئین دارد و 58 tRNA و 18 تا ژن RNA دارد. (Niazi , 2009)
H. influenza در اطفال، باکتریمی، اپی گلوتیت، عفونت گوش میانی، پنومونی، برونشیت، فارنژیت مزمن، مننژیت باکتریایی، اندوکاردیت و ورم ملتحمه ایجاد می‌کند.و به نظر می‌رسد، عفونت هموفیلوس آنفلوانزا فقط در انسان رخ می‌دهد. همه سویه‌های هموفیلوس آنفلوانزا پروتئین‌هایی در غشاء خارجی سلول خود دارند. omp‏ها از انواع بسیاری پروتئین مثل P2، P6، Pdتشکیل شده اند. که از بین آنها P2 پروتئین عمده غشاء، شامل بیش از 50% از OMPs‏ها است. این پروتئین غشاء خارجی به صورت ترایمر21 وجود دارد و به عنوان یک پریون عمل می‌کند. بنابراین بیشتر روی غشای خارجی سویه‌های H. influenzaeNontypeable قرار دارند. (Niazi , 2009). تفاوت‌هایی در فعالیت‌های ایمنی در OMPs‌های خاص به آنتی بادی‌های پلی کلونال و مونوکلونال مشاهده شده است.
وقتی که همان سویه‏ها همچنان در یک بیمار مبتلا به درد مزمن بیماری انسداد ریه ادامه می‌یابند، تغییرات ایمونو شیمیایی در اپی توپ‌های در سطح (ompP2)دیده می‏شود (Martin, D et al, 1993).
2-2- تاریخچه
تعیین توالی در P2 نشان داده است که بخش‌هایی از آن که درون غشای خارجی قرار دارند، دارای سکانس حفظ شده می‌باشند. پروتئین غشای خارجی P2 برای اولین بار توسط Munson و همکارانش شناسایی و خالص سازی شد. مطالعات انجام شده توسط Munson و همکارانش در سال 1992 درجه بالایی از حفاظت از ژن P2 در میان گونه‌های نوع b هموفیلوس آنفلوانزا را نشان داده اند , 1992) . (Sikkema&Murphy.

Sikma و همکارانش، هتروژنسیته بودن ژن ompP2 در سویه‌های بدون کپسول را در مقابل درجه بالای حفاظت همین ژن در سویه b هموفیلوس آنفلوانزا را نشان دادند و همچنین تفاوت در مناطق متغیر باعث تفاوت در جرم مولکولی و تفاوت آنتی ژنی در پروتئین P2است ( Niazi, 2009).
Groeneveldو همکارانش، در سال 1992 نشان دادند که ایمن سازی خرگوش‏ها با باکتری‌های سالم منجر به تولید آنتی بادی‌های ضد P2که تنها در برابر این سویه‏ها مصون بودند شد.و هچنین تغییرات در طول زمان در ژن ompP2 در چندین سویه NTHi که در بیماران مبتلا به COPD کلون کرده بودند را نشان دادند.
Srikumar و همکارانش، در سال 1992 پیش بینی ساختار توپولوژیک پورین NTHI (سویه 1479) به صورت 16 بشکه بتا22 تقریبا یکسان و هشت لوپ در معرض سطح پروتئین و هشت لوپ قرار گرفته در فضای پری پلاسمیک غشای خارجی را کردند. (Sikkema&Murphy, 1992)
Dimopoulou، در انگلیس بر روی هموفیلوس آنفلوانزا کار کرد و متوجه شد، همه سویه‏ها ،بتالاکتاماز مثبت بودند و به امپی سیلین مقاوم بودند.همچنین متوجه شد تشکیل بیوفیلم و تولید بتالاکتاماز به مقاومت آنتی بیوتیکی سویه NTHiکمک میکند. همچنین در شرایط آزمایشگاهی نشان داد که بیوفیلم‌هایNTHi 86-028NP و NTHi 86- 028NPبه غلظت‌های متفاوت (2-20mg/ml ) امپی سیلین مقاوم هستند (Ladani, 1993).
Munsonو همکارانش، نشان دادندکه آنتی بادی علیه پروتئین P2 سروتایپ هموفیلوس آنفلوانزا پروتئین حفاظت بخش در مدل نوزاد موش باکتریمی ‌می‌باشد . (Martin, D et al, 1991)
K-elisa و همکارانش، ناهمگونی آنتی ژنی omp سویه‌هایNontypeable را نشان داده اند, 2002). (Hiltke et al.
Neary و همکارانش، در برزیل نشان دادند که میزان آنتی بادی‌های خاص به لوپ 6، پروتئین P2 خیلی بالاست.و پروتئین P2 برای واکسن یک کاندیدای مناسب هست.
Murphyو همکارانش، در سال 1989 پورین پروتئین P2 را برای تهیه واکسن پیشنهاد دادند (Niazi, 2009).
Munson و همکارانش، در سال 1989با استفاده از SDSژل الکتروفورز نشان دادند که پروتئین P2 در سویه هموفیلوس آنفلوانزاHib دارای وزن مولکولی مشخصی بین 37-40 کیلو دالتون می‌باشد (Martin, D et al, 1991).
Forbes. kj و همکارانش، در سال 1992 در انگلیس نشان دادند که درسویه‌های بدون کپسول هموفیلوس آنفلوانزا بر عکس سویه کپسول دار Hib، اندازه پروتئین P2وابسته به طول ژن می‌باشد و توالی کد کننده DNA در آنها بسیار پلی مورفیسم می‌باشد (Forbes&el, 1992) .
Sanders J. D و همکارانش، در سال 1993 در دالاس ژن ompP2(NTHi) را به ompP2(Hib) جهش یافته غیربیماریزا انتقال دادند و باعث ترمیم ژن Hib شد و دوباره توانایی پاتوژن مانند سویه وحشی خود را بدست اورد. این نتایج نشان می‌دهد که ژن پروتئین ompP2(NTHi) میتواند در غشای خارجی Hib بیان شود و به طور درست عمل کند (Sanders&el, 1993).
Hiltke Tj و همکارانش، در نیویورک سال 2002، ژن (ompP2) ،13نمونه بیمار مبتلا به بیماری انسداد مزمن ریوی را تعیین توالی کردند. در 9 نمونه، تغییری وجود نداشت. در 4 نمونه ،تغییر وجود داشت. بسیاری از این تغییرات در حوزه‌هایDNA تکراری رخ داده است. که این نوع DNA نقش مهمی‌ در تنوع آنتی ژنی ompP2 نشان میدهد. توالی ompP2 در میزبان انسانی نسبتا پایدار است. P2، علاوه بر اپی توپ‌ های متغیر اپی توپ‌های حفاظت شده دارد که می‌تواند کاندید واکسن باشد. (Hiltke, 2001)
Hiltke Tj و همکارانش، در نیویورک سال 2003، با مطالعه بر روی یک بیمار مبتلا به انسداد ریوی به مدت دو سال با استفاده از PFGE و تجزیه و تحلیل توالی ompP2، انتقال افقی ompP2 بین دو سویه در دستگاه تنفسی را نشان داد.مشاهده انتقال افقی ompP2، در دستگاه تنفسی انسان دارای پیامدهای مهم برای درک تنوع ompP2 در میان سویه‏ها و طراحی واکسن بر اساس ompP2 دارد. (Mandell et al, 2010, P. 1079-1171)
هدف این تحقیق، اپیدمیولوژی مولکولی ompP2 در سویه‌های هموفیلوس آنفلوانزای جدا شده از نمونه‌های بالینی است. در ایران مطالعات اپیدمیولوژی روی سویه‌های هموفیلوس آنفلوانزا به ندرت انجام شده و بخصوص از پروتئین P2 هیچگونه اطلاعاتی نداریم و با توجه به اهمیت پروتئین مذکور به عنوان جانشینی واکسن Hib وNTHi و سیاست‌های کلی وزارت بهداشت و درمان و اموزش پزشکی در خصوص گنجاندن واکسن بر علیه هموفیلوس آنفلوانزا در برنامه واکسیناسیون کشوری اینگونه مطالعات روی سویه‌های بومی ‌انجام شود. با توجه به اینکه در دنیا و همچنین ایران هنوز واکسن مناسبی برای سویه‌های NTHi وجود ندارد لذا نیاز به داشتن اطلاعات در مورد پلی مورفیسم احتمالی ژن پروتئین ompP2 داریم. زیرا اگر این تغییرات زیاد باشند، بالطبع این پروتئین کارایی لازم را جهت پوشش دادن سویه‌های متعدد هموفیلوس آنفلوانزا را نخواهد داشت.
فصل سوم:
روش شناسی
3-1- مواد و وسایل:
• سمپلرهای 0. 2 تا 2 و 2 تا 20 و 100 تا 1000 میکرولیتری
• سر سمپلر
• میکروتیوپ‌های 0. 2 و 0. 5 و 1. 5 میلی لیتری قابل سانتریفیوژ
• کرایوتیوپ‌های 2 میلی لیتری
• سرنگ‌های 2 و 5 و 10 میلی لیتری
• پتری دیش‌های باکتریولوژیکی 100 میلی متری
• لام
• لامل
• سواپ استریل
• پیپت
• قطره چکان
• محیط کشت شکلات اگار
• سرم فیزیولوژی
• آگارز
• محلول TBE
• اتیدیوم بروماید
• رنگ کریستال ویوله
• رنگ لوگول
• رنگ فوشین
• الکل استون
• اتانول
• آب مقطردوبار تقطیر
• ماسک
• اسیدبوریک
• EDTA
• Trace
• دستکش لاتکس
• چسب اتوکلاو
• یخ
• لوله شیشه‏ای سانتریفیوژ
• ویال استریل 10 سی سی و 50 سی سی
• پنبه
• میکروپلیت
• سرم فیزیولوژی اپیروژن
• بافر PBS(Ph:7/2)
• فنل
• آب مقطر دوبار تقطیر شده
• اتانول مطلق Merck
• متانول
• ایزوپروپانول
• تری کلرو استیک اسید (T. C. A)
• EcoR1
• EDTA
• اتیدیوم بروماید
• تریس بافر بازی
• آنزیمAlu1
• Mastermix
3-2- دستگاه ها:
• دستگاه PCR
• دستگاه الکتروفورز
• دستگاه Gel Documentation
• دستگاه اسپکتروفوتومتر
• میکروسکوپ نوری
• یخچال 4 درجه
• فریزر 20- درجه
• فریزر 80- درجه
• دستگاه سانتریفیوژ
• شیکر
• دستگاه اسپکتروفوتومتر
• انکوباتور 37 درجه CO2دار
• هود بیولوژیک
• هود شیمیایی
• ترازوی دیجیتالی حساس
• شعله گاز
• تانک الکتروفورز
• مایکروویو
• نرم افزار MEGA4
• هیتر
• اتوکلاو
3-3- محلول سازی:
3-3-1- آماده سازی محیط کشت:
اولین گام در تهیه محیط کشت براورد میزان کل محیط کشت مورد نیاز است. این مقدار از تعداد ظروف کشت و حجم مورد نیاز محیط به ازای هر ظروف به دست آمد. معمولاً برای هر پلیت با اندازه متوسط، 20 میلی لیتر محیط در نظر گرفته شد. مطابق دستور کارخانه سازنده، مقدار محیط لازم از محیط کشت را، که به صورت پودر



قیمت: تومان

دسته بندی : پایان نامه

پاسخ دهید